“异形叶”是指基因型相同的植物由于环境变化导致叶形显著差异的现象,这一现象在水生植物中常见。异形叶植物的水生叶常为深裂、丝状或线形,叶片较薄,气孔密度较低或缺失;而陆生叶的叶形则相对简单,叶片较厚而维管束发达,气孔密度较高。异形叶是研究植物表型与生态环境适应性的理想模型,不同进化地位的异形叶植物在相同环境下具有相似的表型特征,这也为探究植物趋同进化机制提供了独特的研究模型。然而,由于缺乏合适的模式植物,其分子机制研究进展缓慢,异形叶调控机制尚不清楚。
近年来,中国科学院水生生物研究所研究员侯宏伟团队筛选发现一种爵床科水生植物异叶水蓑衣(Hygrophila difformis)的叶形在不同环境条件下存在显著差异,其异形叶特征明显,水生叶和陆生叶具有明显区别(图1)。此外,该植物具有植株大小合适、生长迅速、能够响应多种环境变化等优势(Li et al., 2017)。该团队建立了异叶水蓑衣的稳定遗传转化体系,为探索其分子机制奠定了基础(Li et al., 2020)。近日,该团队以异叶水蓑衣为实验材料,探讨了KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX (KNOX1)基因家族中SHOOT MERISTEMLESS (STM)在异叶水蓑衣叶形发育中的功能,通过遗传学证据证明HdSTM参与异叶水蓑衣的异形叶发育过程。
研究发现,与陆生环境相比,异叶水蓑衣的HdSTM在水生环境中的表达水平显著提高。原位杂交结果表明,不同于拟南芥等模式植物中STM仅局限于茎顶端分生组织的表达模式,HdSTM在茎顶端分生组织、叶缘锯齿或小叶中的表达均较高,其基因表达模式随环境条件的变化而改变,具有显著的物种特异性。在拟南芥中异源过表达该基因能够使其产生叶裂增加等表型,而调控植物器官边界和叶缘发育的CUP-SHAPED COTYLEDON (CUC)基因的表达也显著提高。过表达HdSTM的异叶水蓑衣在陆生环境下无明显叶形变化,而在水淹条件下能够迅速产生深裂叶(图2);HdSTM的RNAi植株叶形及叶序发育受阻,沉水叶的复杂程度显著降低。原位杂交实验表明,HdSTM与HdCUC3表达模式相近。酵母双杂交和BiFC等实验证明HdSTM与HdCUC3存在蛋白互作,这表明HdSTM可能与HdCUC3共同调控异叶水蓑衣的异形叶形成(图3)。该研究首次利用分子生物学证据探明STM参与水生植物异形叶形态发生的调控和机制(Li et al., 2022)。
相关研究成果以SHOOT MERISTEMLESS participates in the heterophylly of Hygrophila difformis (Acanthaceae)为题,在线发表在Plant Physiology上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和中科院国际伙伴计划的支持。
图1.异叶水蓑衣在水生和陆生环境下的异形叶表型:A、陆生植株,B、沉水植株,C、陆生植株水淹后的叶形变化。
图2.沉水条件下HdSTM的过表达植株叶形复杂程度迅速增加:A、野生型及过表达HdSTM的陆生植株,B、野生型及过表达HdSTM的陆生叶形,C、野生型及过表达HdSTM的陆生植株水淹14天后的植株表型,D、野生型及野生型及过表达HdSTM的陆生植株水淹14天后的叶形。
图3.酵母双杂交和BiFC验证HdSTM和HdCUC3的互作关系:A、酵母双杂交,B、BiFC实验。
来源:中国科学院水生生物研究所
文章信息
题目:SPATULA and ALCATRAZ confer female sterility and fruit cavity via mediating pistil development in cucumber
刊名:Plant Physiology
作者:Zhihua Cheng,Xiaolan Zhang et al.
单位:China Agricultural University
日期:07 April 2022?
01
摘要
水果的种子在植物有性生殖和人类饮食中起着重要作用。成功的受精包括将花粉管中的精细胞沿着传输通道(TT)输送到子房内的卵细胞。果腔是直接影响黄瓜(Cucumis sativus)商业价值的不良性状。然而,在作物中,果腔的形成和生育力决定的调控基因仍然未知。在这里,我们描述了黄瓜中的一个基本螺旋环螺旋(bHLH)基因SPATULA(CSPT)及其与ALCATRAZ(CsALC)的冗余和发散功能。CsSPT转录物在生殖器官中富集。CsSPT突变导致黄瓜生育能力降低60%,种子仅在果实上部产生。由于心皮分离,Cspt-Csalc突变体表现出完全丧失生育能力和果腔。进一步的研究表明,双突变体的柱头向外翻转,柱头同一性有缺陷,异常TT中的细胞外基质含量显著减少,这导致花粉管无延伸路径,胚珠无受精。生化和转录组分析表明,CsSPT和CsALC在同二聚体和异二聚体中发挥作用,通过介导参与TT发育、生长素介导的信号传导和黄瓜细胞壁组织的基因,赋予果腔和雌性不育。
02
技术路线
Cucumber (Cucumis sativus L.) inbred line XTMC (North China type ‘Xintaimici’)
Gene cloning and structural *** ysis
RT-qPCR
In situ hybridization
Subcellular localization
Cucumber transformation
Measurement of fruit physiological indexes
canning electron microscopy (SEM) observation
Pollen viability assays
In vivo pollen tube aniline blue staining
Alcian blue staining of tran *** itting tracts
Transcriptome *** ysis
Yeast two-hybrid assay
Bimolecular fluorescence complementation
Yeast one-hybrid assay
03
主要结果
3.1 黄瓜的生殖器官中富含CsSPT转录物
为了探索与黄瓜种子发生相关的基因,在CuGenDB数据库中搜索SPATULA的同源物(SPT:AT4G36930),因为SPT在拟南芥的育性维持中的作用。获得了具有更高相似度的Csa6G491000,并在下文中命名为CsSPT。CsSPT编码一个bHLH蛋白,具有八个外显子和七个内含子。RT-qPCR显示CSPT在生殖器官中高度表达,如雄性/雌性芽、雄蕊和子房。原位杂交表明,CsSPT转录物在发育中的花瓣、雄蕊和心皮原基中富集(图1,A-D)。在子房内部,CsSPT转录物在隔膜和胚珠原基中积累(图1,E)。亚细胞定位显示CSPT-GFP融合蛋白的荧光分布在细胞核中。
Fig. 1 A-E
3.2 Csspt-Csalc双突变体的果腔形成和雌性不育
考虑到SPT和ALC的推定的功能冗余,使用CRISPR-Cas9系统同时靶向CsSPT和CsA256640,并获得了5个T0独立的CsSPT-CsALC敲除植物。由于两个基因在不同染色体上的位置,分离出两个纯合Cspt单突变系。与野生型对照XTMC(WT)相比,Csspt和Csalc单突变体的果实显示出不分化的表型,而Csspt-Csalc双突变体果实似乎在上部较薄,内部有空腔(图1F)。在野生型果实中,心皮数量从3-5不等,所有心皮融合在一起形成完整的肉质果实。
有趣的是,Csspt-Csalc突变体果实的心皮彼此分离,导致内部形成明显的中空(图1,G)。然而,Csspt-Csalc水果中的主要代谢产物(可溶性糖/蛋白质/固体)和水含量与WT中的相当(图1,H-K)。
此外,在Csspt和Csspt-Csalc突变体中观察到生育缺陷。当Cspt突变体与野生型花粉自交或杂交时,每个果实收获的种子数分别为133.3±22.4和123.3±15.4,降至野生型自交(315.5±72.7)的40%左右(图1,L和N)。类似地,Csalc突变体显示雌株生育能力降低了95%(未发表的数据)。
在Cspt敲除的果实中,饱满的种子主要分布在子房顶端附近的上部,种子室的长度明显短于WT(图1,L)。在Csspt-Csalc双突变体中,当Csspt-Csalc用作母本时,雌性育性完全丧失,没有获得种子。同时,由于心皮分离,在果实内部沿纵向检测到明显的裂缝(图1,L和M)。然而,当Csspt或Csspt Csalc用作花粉供体使WT受精时,每颗果实的种子数与WT自花授粉相当(图1,L和N),这表明Csspt和Csalc在生育力中的作用是雌株特有的。
同样地,花粉活力染色和体外发芽试验表明,Cspt和Cspt-Csalc突变体的花粉形态不变,90%以上的花粉是活的(补充图S2 C-E)。这些数据表明,CsSPT和CsALC在调节黄瓜心皮融合和女性生育能力方面具有冗余功能。
Fig. 1
3.3 Cspt-Csalc突变体柱头和花柱的形态存在缺陷
为了剖析果实中空和雌性不育的假定原因,我们详细分析了雌蕊发育。与WT中的柱头会聚不同,Csspt和Csspt-Csalc突变体中的柱头向外卷曲,就像花冠开口一样(图2,A-D)。
SEM观察表明,在早期发育阶段,WT柱头裂片聚集在一起,而Cspt-Csalc柱头裂片彼此分离并向外转向平坦(图2,E-L)。开花时,当 *** 状细胞可用于授粉时,Csspt或Csalc单突变体的柱头适度开放,而在Csspt-Csalc双突变体中,柱头完全开放,从而暴露内部结构(图2,M-P)。
此外,与WT相比,Cspt-Csalc柱头上 *** 状细胞的大小显著减小。与WT中的球状细胞形状不同,Cspt Csalc的柱头 *** 状细胞变得扁平和紧密,甚至形成气孔(图2,M’-P'),表明柱头有缺陷。
定量分析表明,Csspt、Csalc和Csspt-Csalc突变体的柱头宽深比分别为1.6±0.4、1.2±0.1和2.4±0.5,均显著大于WT(1.1±0.1)(图2Q)。Csspt、Csalc和Csspt-Csalc突变体的长宽比分别为2.0±0.4、1.4±0.2和1.6±0.4,也显著大于WT(1.2±0.2)(图2,R)。上述数据表明,在Cspt-Csalc双突变体中柱头和花柱形态严重破坏,在Csspt和Csalc单突变体中程度较低,表明这些突变体的顶端雌蕊同一性程度不同。
Fig. 2
3.4 Csspt和Csspt-Csalc突变体雌蕊花粉管延伸受阻
为了研究突变体中雌株缺陷的原因,首先,通过苯胺蓝染色对黄瓜WT雌蕊的花粉管延伸进行了时间过程观察。如补充图S3所示,授粉后2小时,花粉管伸出柱头并开始渗入花柱传递道(TT)。
5小时时,花粉管束穿过花柱并进入子房,但未到达1/4子房(子房指的是没有雌蕊柄的子房部分)(补充图S3 A)。10小时时,花粉管延伸超过1/4子房,但未到达1/2子房。横切面显示花粉管主要分布在TT内侧。在20小时时,花粉管束超出1/2子房,越来越多的花粉管出现在侧TT处,其中一些花粉管开始瞄准胚珠。25小时时,花粉管继续向下移动,在1/4和1/2子房的横向TT处花粉管密度进一步增加。在35小时时,花粉管在内侧、外侧和末端传递道处丰富。从25小时到35小时,很容易观察到花粉管进入胚珠的现象(补充图S3 B)。
接下来,比较WT和突变体雌蕊授粉后30小时花粉管在雌蕊内的延伸。纵向切片显示,与WT中的花粉管相比,在Csspt雌蕊中导航的花粉筒的密度显著降低(图3,A和B),而在WT中观察到的,Cspt雌蕊中的胚珠可以被花粉管瞄准(图3、A’和B’)。相反,Csalc-突变体的子房中的密集花粉管出现在侧TT,但没有沿着末端TT延伸到目标胚珠(未发表的数据)。
在Csspt-Csalc突变体中,花粉管聚集在雌蕊顶部,无法穿透柱头和花柱(图3,C和E)。横切面显示,与野生型相比,Cspt突变体柱头、花柱和卵巢的花粉管密度显著降低(图3,F-M)。在Cspt卵巢中展开的花粉管很容易像在WT中一样进入胚珠(图3,I’和M’)。一致地,在所有Csspt-Csalc雌性生殖道中都没有检测到花粉管,因此没有胚珠受精(图3,N-Q')。
Fig. 3
3.5 Csspt和Csspt-Csalc突变体传递通道的结构变化
考虑到拟南芥中TT缺陷导致的spt突变体的育性降低,我们在WT和突变体雌蕊中通过Alcian蓝染色进行了TT结构观察。Cspt花粉管中细胞外基质(ECM)的含量显著低于WT,尤其是在中间区域,几乎不可见(图4,A-B’)。在Csspt-Csalc突变体中,除了缺少ECM外,还观察到TT结构和形态的明显变化(图4,C和C’)。
在子房中,Cspt突变体的TT与WT的TT相似,由2-3层不规则细胞组成,彼此紧密贴合,ECM含量略有降低(图4,D-E’)。而在Cspt-Csalc突变体中,TT由两层规则且均匀的细胞组成,ECM产量显著减少(图4,F和F')。
为了探讨Cspt-Csalc突变体TT结构缺陷的发生阶段,在开花前8天(8 DBA)、4 DBA、2 DBA、AD(开花日)和3 DAA(开花后)的一系列时间点比较TT形态。从8 DBA到4 DBA,WT和Csspt-Csalc突变体之间的TT分化没有明显差异,这两个突变体都包含两层规则细胞(图4,G-J)。
从4 DBA到开花,在WT中,部分原始TT细胞扩增,产生了一些新的细胞,从而产生了具有致密细胞分布的致密传输道组织(图4,I,K和M)。而在Cspt-Csalc突变体中,TT细胞保持不变(图4,J,L和N)。
在3 DAA时,WT中的TT细胞似乎受到抑制和降解,而Csspt-Csalc突变体中的那些细胞仍然规则且清晰,难以区分(图4,O和P)。到那时,沿着TT的分裂变得可见,并在双突变体中产生果腔(图4,Q和R)。木质素染色显示,WT中TT细胞中存在分散的木质素,而在Csspt Csalc突变体中,木质素富集在两个细胞层的中间,导致心皮分离和空洞形成(图4,S和T)。
Fig. 4
3.6 Csspt和Csspt-Csalc传输通道中AGP的减少
据报道, *** 半乳聚糖蛋白(AGPs)是TT细胞外基质的重要成分,在雌蕊花粉管延伸过程中发挥着关键作用。使用单克隆抗体JIM8和JIM13对WT和突变体中的AGP在开花时的花柱TT和子房TT上进行评估。与阴性对照(图5A和I)相比,TT中检测到JIM8和JIM13信号,Csspt和Csspt-Csalc突变体的荧光范围和强度远低于WT(图5,B-D和J-L)。这一结果解释了Cspt突变体穿透花柱和在卵巢内传播的花粉管数量急剧减少的原因。
在子房中,与阴性对照相比(图5,E-E“”),JIM8信号在TT和胚珠中明显富集,尤其是在胚囊和WT的外珠被内层(图5、F-F’)。在Csspt和Csspt-Csalc突变体中,TT中的JIM8信号明显较弱,更强的荧光分布仅限于胚珠珠被和胚囊(图5,G-H’)。类似地,与野生型相比,JIM13信号显示突变体中的TT显著减少(图5,M-P’)
Fig. 5
3.7 Cspt-Csalc突变体中柱头和TT发育相关基因表达减少
为了探索CsSPT和CsALC的推定下游基因,选择含有柱头和CsSPT、CsALC和CsSPT-CsALC突变体样式的顶端雌蕊进行转录组分析。与WT相比,Csspt中有63个上调基因和157个下调基因,Csalc-中有122个和149个,Csspt-Csalc中1327个和732个(FC>2,p<0.05)。
GO分析显示,Cspt-Csalc突变体中差异表达的基因(DEG)富含生长素激活的信号通路、细胞壁组织和防御反应(补充图S4,B)。热图显示,参与细胞壁组织的基因大多上调,参与生长素激活信号通路(AUX/IAA家族、生长素应答因子、膜转运蛋白和蛋白激酶结构域)的基因在Csspt-Csalc突变体中下调(图6,A)。据报道,Csa1G042820、Csa1G427480和Csa5G576590是黄瓜中生长素外排载体的同源物,分别命名为PIN-FORMED1a(CsPIN1a)、CsPIN2和CsPIN3。Cs1G537400是在黄瓜生长素运输中发挥作用的蛋白激酶PINOID。
WT和Csspt、Csspt-Csalc突变体柱头和子房上的RT-qPCR显示,所有这些生长素转运基因在Csspt-Csalc突变体的柱头中显著下调,但在卵巢中没有下调(补充图S4,C-D)。有趣的是,在TT发育中起作用的拟南芥NTT(AT3G57670)和BEE3(AT1G73830)的黄瓜同源物、Csa3G810580类CsANTT和CsA1G24150在Csspt-Csalc突变体中显著下调。
RT-qPCR证实了转录组结果,并显示Csspt-Csalc突变体的柱头和卵巢中的CsNTT样和CsBEE3表达显著低于WT(图6,B-E)。为了进一步探讨CsNTT样和CsBEE3与CsSPT和CsALC的关系,进行了酵母单杂交试验,然而,没有发现相互作用(补充图S5,A和B),这表明CsSPT与CsALC对CsNTT-样/CsBEE3的转录调节在黄瓜中是间接的。
Fig. 6
3.8 CsSPT、CsALC和CsWOX1之间的蛋白质相互作用
在拟南芥中,SPT和ALC相互形成蛋白质二聚体,以发挥其生物学作用。为了探讨CsSPT和CsALC之间存在的相互作用,进行了酵母双杂交试验。CsWOX1被用作蛋白质相互作用的候选基因,这是由于TTs与CsSPT和CsALC的表达模式重叠。CsALC和CsALC、CsSPT和CsARC、CsALC与CsWOX1之间存在强烈的相互作用,CsSPT与CsSPT、CsSPT与CsWOX1之间存在中等程度的相互作用(图7,A)。
接下来,进行了BiFC分析,并验证了CsSPT和CsSPT、CsSPT与CsALC、CsALC与CsAALC、CsARC与CsWOX1的相互作用,但CsSPT及CsWOX2的相互作用没有(图7,B)。这些数据表明,一种蛋白质伴侣CsWOX1与黄瓜中的CsSPT-CsALC模块相互作用。
Fig. 7
04
结论
我们的数据通过在黄瓜(一种重要的农业作物)中介导TT发育和心皮融合,确定了 CsSPT和CsALC在果腔形成中的作用(图8,C)。
在Cspt-Csalc双突变体中,生长素应答因子和生长素转运蛋白(CsPIN1a、CsPIN2、CsPPIN3、CsPID)显著减少(图6),这表明Csspt和Csalc通过积极介导黄瓜中的生长素通路调节柱头和花柱发育(图8,C)。
HAF/BEE1/BEE3的两个同源物中的一个在Csspt-Csalc 突变体中显著减少,这意味着两个TT发育基因在黄瓜中作用于Csspt和Csalc的下游,尽管调节可能是间接的(图6、图8和补充图S5)。
未来的研究需要剖析NTT和BEE3介导的黄瓜TT发育和雌株生育力测定的种具体机制。
Fig. 8
05
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原文链接:
https://academic.oup.com/plphys/article-abstract/189/3/1553/6564671?redirectedFrom=fulltext#
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中美科学家合作揭示甘蓝型油菜育性相关基因功能与进化历史New Phytol. | 中国农科院油料所/美国宾夕法尼亚州立大学合作揭示甘蓝型油菜育性相关基因功能与进化历史
撰文 | 曾新华、李浩
责编 | 逸云
新基因(或类群特异基因)存在于几乎所有已被全基因组测序的动植物中,并对关键创新性状的产生和物种多样性具有重要作用【1】。雄性不育是油菜杂种优势利用的最主要途径,发掘具有实用价值的油菜雄性不育基因对我国油菜雄性不育系统研究具有重要意义。已有研究表明,MS5基因是油菜中与雄性育性相关的新基因,具有多个对雄性育性有不同作用的等位基因【2】。
近日,中国农业科学院油料作物研究所油料基因工程与转基因安全评价团队和美国宾夕法尼亚州立大学马红团队合作在New Phytologist在线发表题为Evolution of the Brassicaceae-specific MS5-Like family and neofunctionalization of the novel MALE STERILITY 5 gene essential for male fertility in B. napus的研究论文。该研究揭示了MS5基因在十字花科植物中的进化历史,并在前期油菜中成功克隆雄性不育基因BnMS5d的基础上,进一步揭示了BnMS5 基因在甘蓝型油菜小孢子母细胞减数分裂过程中的功能。这一研究为利用基因工程技术创建甘蓝型油菜雄性不育系统提供了重要理论依据与基因资源。
该研究首先通过对83种植物(包括23种十字花科植物)的全基因组序列进行同源基因搜索,发现了727个MS5同源基因,并且这些基因仅在23种十字花科植物中存在,说明这些基因组成了十字花科植物类群特异的一个基因家族(MS5-Like family)。进一步分析表明这些基因可能通过多次串联重复事件和转座事件、以及基因丢失事件,在不同十字花科物种中保留了不同数目的MS5同源基因。例如,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有18个,而在亚麻荠(Camelina sativa)中有多达119个基因成员。在该基因家族中,BnMS5所在的分支含有来自8个物种的14个同源基因,这些同源基因及它们的上下游基因在不同物种中具有较好的基因共线性关系。
Classical genetic model and three-line hybrid breeding procedure of the genic male sterile system TE5ABC in B. napus
异源四倍体的甘蓝型油菜是二倍体白菜(B. rapa)和二倍体甘蓝(B. oleracea)的杂交后代。结合系统发育及序列分析得出:在甘蓝型油菜的基因组中含有两个MS5同源基因座位,其中一个基因(BnMS5)来自于白菜中的祖先基因,而另一个来自于(BnMS5II-1)来自于甘蓝中祖先基因。BnMS5基因含有至少三个等位基因(BnMS5a、BnMS5c和BnMS5d),MS5a和MS5c产生于白菜和甘蓝分化之前,在甘蓝型油菜的不同个体中分别获得了MS5a或MS5c,而BnMS5d与BnMS5a相比,仅有一个核苷酸位点的差异。
Synteny of the MS5 locus-related genomic regions in nine Brassicaceae genomes and two outgroup species
该研究对BnMS5基因的表达和功能作了详细分析。通过检测转基因互补实验获得的T0阳性单株的外源基因拷贝数,结果表明BnMS5a基因与BnMS5d基因通过剂量效应来调控甘蓝型油菜育性。免疫组化实验结果表明,BnMS5蛋白定位在细胞核核膜上,在正常可育花粉母细胞减数分裂细线期后期和粗线期早期与染色体端粒共定位,但在不育材料中则不能与染色体端粒共定位。
Subcellular localization of BnMS5a and BnMS5d relative to telomeres during early meiosis
最后该研究还利用酵母双杂交证明BnMs5a和BnMs5d蛋白均能与SUN蛋白互作,而BnMs5c蛋白不能与SUN蛋白互作。这表明在基因型为BnMS5aBnMS5a的甘蓝型油菜花粉母细胞减数分裂过程中,BnMS5a/SUN蛋白复合体起着十分重要的作用。虽然BnMS5a基因突变成BnMS5d后会导致甘蓝型油菜雄性不育,但这个单碱基突变并未影响BnMs5d蛋白与SUN蛋白的互作。BnMs5a与BnMs5d蛋白可能是通过剂量效应或者是竞争性结合在甘蓝型油菜花粉母细胞减数分裂过程中起作用。
Evolutionary history of BnMS5 and a potential model underlying the establishment of different functions by BnMS5 alleles.
总之,BnMS5基因属于十字花科植物类群特异的基因家族,推测可能在白菜起源后发生了基因新功能化,进而在源于白菜和甘蓝的甘蓝型油菜杂交后代中对雄性育性具有重要作用。
中国农业科学院油料作物研究所的曾新华博士和美国宾夕法尼亚州立大学的李浩博士为该论文的共同之一作者,中国农业科学院油料作物研究所的闫晓红博士、吴刚博士和美国宾夕法尼亚州立大学的马红教授为共同通讯作者。该项研究工作得到国家自然科学基金以及中国农科院科技创新工程项目资助。
参考文献:
1. Rodelsperger et al. 2019. Trends Genet 35, 914-922.
2. Zeng et al. 2016. Front Plant Sci 7, 1966.
论文链接:
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.17053
桃近核果肉发红机理获揭示新华社讯(记者谭元斌)吃桃的时候,稍加留意,会发现有些桃挨着果核的果肉是红色的,这种“近核红”是桃特有的现象。中国科学院武汉植物园的一项最新研究,找到了导致桃近核红性状形成的重要基因并阐明了其分子机理。
据该团队专家介绍,在桃果实发育后期,靠近果核处的果肉因花青苷积累而变红。此前,这种近核红性状产生的原因和机理尚不清楚。科研人员采用比较转录组 *** 挖掘调控桃近核红性状形成的重要基因PpHY5,通过酵母双杂交筛库得到其关键的协同因子PpBBX10,确认PpHY5在PpBBX10的协同下促进桃果实PpMYB10.1基因的转录激活,从而产生桃近核红现象。
据悉,近核红性状不利于罐装桃产业发展。团队专家透露,罐装桃为黄肉或白肉,近核红桃品种若要做罐装桃,须对红肉进行额外处理,增加生产成本。因此,这一成果不仅丰富了果肉着色调控研究,也有望应用于桃育种,为罐装桃产业提供更多优质的无近核红性状的桃品种。研究也表明,可能存在未知的调节因子参与调控桃近核红性状。相关研究成果近日已发表于国际期刊《植物杂志》。
【来源:连云港市科技局_科技前沿】
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实验技能丨酵母双杂交实验超详细protocol实验原理
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如,酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是,单独的DNA结合域不能激活基因转录,单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
实验步骤
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为:
1、构建重组Activation Domain(AD)融合的重组质粒(pGADT7载体)以及Binding Domain(BD)融合的重组质粒(pGBKT7载体);
2、双向酵母双杂交实验鉴定蛋白质间的相互作用
2.1 酵母转化中DNA 混合液的配制
在制备酵母感受态的过程中配制下面的DNA 转化混合液(1×):
2.2 酵母感受态细胞的制备以及共转化
下面是所需用量为10 个转化实验的酵母感受态细胞的制备。
(1) 挑取平板上AH109 酵母细胞的单个克隆至5 ml YPD 培养基中,30℃
摇床振摇培养过夜(可加入2 mg/ml 的Adenine 75 μl 使酵母生长速度加快);
(2) 转接2.5 ml 过夜培养的菌液至50 ml YPD 培养基中继续培养约3-4 h(OD600~2-4);
(3) 用50 ml 的离心管收菌,4,500 rpm,3 min;弃上清;
(4) 加入20 ml 无菌水洗涤,同样条件离心;弃上清;
(5) 用1 ml 无菌水重悬菌液,转移至1.5 ml 的EP 管中;
(6) 更高速短时离心15 sec;弃上清;
(7) 加入450 μl LiAc (0.1 M) 重悬菌体,30℃摇床振摇培养15 min;
(8) 分装50 μl/管至EP 管中;
(9) 更高速短时离心15 sec;弃上清;
(10) 每管加入已经配制好的DNA 转化混合液(可加入40 μl DMSO 以提高转化效 率),彻底重悬细胞,30℃摇床振摇培养45 min;
(11) 转移至42℃水浴20 min;
(12) 冰上放置3 min;
(13) 更高速短时离心30 sec;弃上清;
(14) 加入100 μl 无菌水重悬菌体,涂布于SCM/-2(缺少色氨酸和亮氨酸的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上。30℃恒温箱倒置培养3 天后观察菌落生长情况。
2.3 酵母双杂系统相互作用的筛选
(1) 3 天后,在转化后的平板上各挑取四个单菌落,分别划线于SCM/-2、
SCM/-3 (缺少色氨酸、亮氨酸和组氨酸的酵母合成培养基) 和SCM/-4 (缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上,30℃恒温箱倒置培养3 天后观察菌落生长情况。
(2) 如果菌落能在SCM/-4 平板上正常生长,说明AD-fusion 和BD-fusion两者之间有强的相互作用;如果不能在SCM-4 平板上正常生长但是能在SCM/-3平板上正常生长,则有弱的相互作用;如果在SCM/-4 和SCM/-3 平板上均不能生长而只能在SCM/-2 平板上生长,则无相互作用。
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猕猴桃非乙烯和乙烯杂交成熟响应,与MADS转录因子的差异调控有关文 | 小魏档案
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?——【·前言·】——?
在所有肉质水果中,果实成熟和成熟是通过复杂的代谢过程实现的,这些代谢过程由发育和荷尔蒙因素调节。
虽然生长素、脱落酸和细胞分裂素等激素都与成熟过程有关,但最典型的激素是乙烯,因为它在许多水果中具有极端的成熟作用。
乙烯从蛋氨酸通过S-腺苷甲硫氨酸合成酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶和ACC氧化酶以简单的三步途径合成。
所有这些基因都与多基因家族有关,在许多植物中,ACS已被证明是乙烯生物合成的限速步骤。
ACS基因家族由三类基因组成,取决于羧基末端中是否存在不稳定元件,这些元素由F-box基因乙烯超过生产者调节。
在具有自催化乙烯相关成熟的水果中,这些生物合成基因家族中的每一个的特定成员都与成熟有关,当受到抑制时,观察到成熟度损失或减少。
一、水果感知乙烯的方式
水果通过多步信号通路感知乙烯,该通路始于乙烯与内质网中发现的双组分跨膜受体复合物结合。
在番茄和拟南芥中已鉴定出多种乙烯受体和乙烯传感器复合物,这些复合物也被证明可以结合乙烯。
乙烯与这些受体的结合抑制了大部分线性途径,最终导致调节乙烯反应基因的EIN3转录因子家族的稳定。
转录因子如鳞片结合蛋白,无色不成熟,乙烯反应因子以及各种MADS-box基因调节下游成熟基因。
在番茄、草莓、苹果、香蕉和葡萄中,成熟和乙烯前成熟事件也与与花器官同一性相关的MADS盒转录因子类基因有关。
这些包括SEP样成熟抑制剂、FRUITFUL样TDR4和AGAMOUS样TAGL1,它们相互作用以打开成熟相关基因,例如参与乙烯生物合成的基因。
二、猕猴桃对食用成熟度的软化方式
黄肉猕猴桃“Hort16A”果实的成熟是一个复杂且高度协调的过程,涉及果肉质地和颜色的变化,淀粉转化为可溶性碳水化合物以及味道和香气化合物的发展。
猕猴桃属的一个主要成熟变化是质地,从坚硬的质地到柔软的熔融质地。猕猴桃对食用成熟度的软化主要是在没有任何可检测到的乙烯的情况下发生的。
尽管坚硬的果实可能对外源性施加的乙烯非常敏感。 这种对乙烯的反应能力在葡萄藤上的果实中逐渐发展。
当映射到物候生物学联邦,联邦工业和工业发展规模时,成熟的初始阶段发生在明显没有乙烯生产的情况下。这类似于在葡萄等“非气候”水果中观察到的成熟过程。
然而,尽管在第1阶段成熟期间未检测到乙烯产生,但乙烯抑制剂1-甲基环丙烯可以延迟快速软化效应,表明对果实中基础乙烯水平有反应。
一旦果实变软,就会进入第二个成熟阶段,其中自催化乙烯的产生与挥发性酯和萜烯合成的显著增加和衰老有关。
因此,尽管猕猴桃在很大程度上被称为自催化乙烯响应水果,但生理证据表明,猕猴桃的行为与典型的更年期水果不同。
相反,应该将其视为非更年期-更年期连续体的一端,其中乙烯生产发生在成熟过程结束时。
三、基因组技术对果实的作用
表达序列标签测序、分子图谱和转化方案等基因组技术极大地帮助了在分子水平上理解猕猴桃物种。
许多研究已经确定了成熟相关乙烯生物合成基因ACO,ACS和SAM合酶的个体成员以及乙烯信号成分,包括组成型三重响应,乙烯响应传感器和乙烯响应1样基因。
在这项研究中,我们利用羊草'红阳'的基因组信息来鉴定乙烯相关基因和已知的果实成熟控制者。
研究了它们在果实成熟和成熟的关键时间点的表达,以更好地了解猕猴桃中观察到的异常成熟过程。
四、控制杂交成熟的机制
在所有水果的发育过程中,都有一段时间的水果变得能够成熟。这是水果特性的重大变化,因为它改变了水果,使其对种子传播生物更具吸引力,并且通常与种子成熟相吻合。
植物激素生产的大幅变化通常促进了这种转变,尤其是乙烯。在番茄和葡萄等模型水果品种中,分子对一些关键开关如何调节这种转变的理解越来越多。
在番茄中,成熟主要由乙烯调节,而在葡萄成熟中,乙烯的作用相对较小。在分子水平上,研究得更好的调节因子是RIN MADS-box基因。
它与FUL/TDR4FUL2和/或TAGL1在异四聚体复合物中起作用,以结合和激活许多与果实成熟相关的基因。
在番茄,香蕉,草莓和苹果的果实成熟过程中,RIN高度且持续上调,并且在番茄中,FUL/TDR4RIN复合物已被证明可以结合并激活乙烯生物合成基因ACS2,4和RIN本身的启动子。
在这项研究中,我们已经表明,RIN样基因与自催化乙烯相关的成熟有关。与番茄RIN不同,但与葡萄VviSEP4一致,成熟后,这种猕猴桃RIN样基因的表达降低。
表明葡萄和猕猴桃RIN不能自动激活自身,甚至表明在此期间存在额外的抑制。乙烯能够在番茄和猕猴桃中诱导RIN表达,但是在猕猴桃中,随后乙烯的去除导致该基因再次下调。
进一步支持镇压机制。在烟草中进行的瞬时实验表明,当AcFUL发育开启或乙烯诱导RIN表达时,猕猴桃RIN不会激活RIN并且RIN表达没有增加,这表明控制杂交成熟的机制。
五、细胞壁相关基因的机智
虽然猕猴桃1期成熟的调控剂尚未完全确定,但关键的候选者是FUL/TDR4样基因,该基因在番茄中已被证明是许多成熟因子的主要控制者。
在猕猴桃中,FUL的增加与快速软化的开始相吻合表明细胞壁相关的基因的机制上调。
这与番茄一致,作者假设SlFUL/TDR4控制乙烯非依赖性成熟过程,我们在猕猴桃中的研究结果将支持这种情况独立于RIN发生的说法。
在乙烯存在下,这些细胞壁基因上调,这可能是由于在其启动子中存在RIN或其他乙烯相关顺式元件。
这些基因的瞬时激活与成熟后期的持续激活之间的转换可以通过FUL的发育控制的上调来解释。
TAGL1是MADS-box复合物的第三个猕猴桃基因,在之一阶段成熟期间的发育过程中似乎没有变化。TAGL1与乙烯相似,部分上调类似于番茄,但不是以持续的方式。
六、乙烯处理后猕猴桃的颜色变化
在这项研究中,第三个花同一性样基因随着果实过渡到成熟能力,表达量大幅下降。AP3番茄同系物TDR6也在果实成熟早期表达,在成熟时下调。
有趣的是,在酵母4杂交实验中显示出与TDR2的可能相互作用。与拟南芥AP3一致,该表达似乎是自动抑制性的,在成熟果实中的表达减少,并且受到乙烯的抑制。
该基因是否在成熟调节中发挥作用还有待观察。随着果实的成熟,对乙烯的敏感性增加,随着时间的推移,较低浓度的丙烯会引起更显着的反应。
各成熟响应对乙烯和丙烯的敏感性不同,糖类对乙烯和丙烯的敏感性较高,果实硬度较低。这意味着在猕猴桃中存在与苹果类似的敏感性依赖机制。
有趣的是,猕猴桃的颜色变化在乙烯处理后几乎没有影响,这表明脱绿可能与发育控制而不是乙烯有关。
在转录水平上,乙烯导致CBP转录减少,表明一些与颜色相关的机制被乙烯转录调节。然而,缺乏表型变化可能部分是由于本研究中使用的短5天评估期。
七、鉴定与乙烯生物合成和转导相关的基因
由于乙烯的产生和感知是响应时间维度的核心,我们进行了一项详细的研究,以确定猕猴桃基因组中的所有乙烯生物合成和信号转导基因。
使用自动注释基因的列表,我们搜索了与乙烯生物合成和转导途径相关的描述符。鉴定了十个注释的SAM合成酶基因,其中只有一个先前已被鉴定。
选择了1个ACCSYNTHASE样基因,只有一个已发表。在其他物种中,ACS蛋白被分为三类,取决于磷酸化位点和WVF和RLSFC端TOE结构域的存在,赋予蛋白质不稳定性。
三种ACS蛋白仅含有RLSF,一种具有两个结构域,九种均没有这些结构域,II类ACS蛋白通过F-Box蛋白乙烯超生产者的作用迅速降解。
在猕猴桃基因组中鉴定出54个ETO样基因,有ACC氧化酶注释基因。这些基因模型的蛋白质序列的比对表明,具有类似于ACO样基因的一级结构。
在乙烯检测和信号转导途径中,在注释的猕猴桃基因模型中鉴定出45个注释的乙烯受体,其中5个已经发表。
进一步的分析表明,其中两个模型没有所有的受体结构域,一个被截断,表明这些不是功能受体。
乙烯受体分为四大类基因,包括乙烯RESPONSE1,乙烯反应SENSOR1/永不成熟,乙烯INSENSITIVE4和乙烯RESPONSE2ETR3样基因。
猕猴桃在所有这些基因类别中都有代表性的基因。乙烯信号的转录控制是通过乙烯INSENSITIVE3和乙烯响应因子/APETALA2类基因进行的。
在注释的猕猴桃基因中,观察到209个EIN2样基因和182个ERF/AP样基因,其中具有保守的DNA结合结构域。
八、总结
番茄的成熟主要由乙烯控制,而在葡萄等水果中,它主要由其他激素控制。许多猕猴桃物种的成熟反应是非典型的。
大多数与成熟相关的水果淀粉水解、变色和软化发生在明显没有乙烯生产的情况下,而第二阶段成熟需要自催化乙烯生产,并且与进一步软化和香气挥发物增加有关。
为了剖析黄肉猕猴桃的成熟反应,进行了二维发育阶段X乙烯响应时间研究。随着果实成熟和之一阶段成熟,果实用不同浓度的丙烯和乙烯处理。
在第1阶段成熟开始时,经过处理的果实对乙烯有反应,并且能够产生内源性乙烯。随着果实进入之一阶段成熟,果实对乙烯的反应减弱,内源乙烯的产生受到部分抑制。
在之一阶段成熟即将结束时,果实再次能够产生高水平的乙烯。通过之一阶段成熟的进展与乙烯无反应的MADS-box FRUITFUL样基因表达的发育增加相吻合。
然而,对乙烯的反应能力与另一种MADS-box基因SEPALLATA1/成熟抑制剂样表达的变化相吻合。
SEP1/RIN的启动子被证明是由EIN1样转录因子激活的,但与番茄不同,不是通过SEP4/RIN本身。猕猴桃中SEP4/RIN的短暂过表达导致乙烯产量增加。
非乙烯/乙烯成熟反应是番茄和葡萄成熟进程的杂交种,之一阶段类似于在葡萄中观察到的RIN/乙烯抑制反应,第1阶段类似于在番茄中观察到的RIN相关的自催化乙烯反应。
随着更灵敏的检测器的发展,以及在经典模式生物之外使用分子工具,自催化乙烯相关和非乙烯相关果实成熟之间的区别已经减弱。
在这里,我们提出了一个模型其中,通过乙烯调节RIN样基因和乙烯非依赖性FUL/TDR4样基因调控的变化,这两类果实成熟差异并不大。
不同类型酵母杂交促进各类啤酒出现根据英国《自然·生态与演化》杂志发表的两篇论文,不同类型酵母杂交可以促进杂交种适应酿造环境,促进不同类型啤酒出现。
几千年来,人类一直使用酵母制造不同的发酵产品,如啤酒和红酒。人类通过驯化方式创造出了许多可以适应不同工业环境的酵母品种,它们是综合了不同亲本种独特特征的杂交种。
比利时VIB-KU鲁汶微生物学中心科学家凯文·维斯特里芬及同事,此次测序了应用于工业生产活动(包括酿造)中的200种酵母的基因组,发现其中四分之一的酵母是4种亲本种的杂交种,并指出杂交帮助综合了可以改进酿造工艺的性状,比如耐冷和糖发酵。研究人员发现,如今的拉格酵母缺少遗传多样性,这可能是因为19世纪末培养、冷藏和供应的酵母菌株只有少数。但是,比利时的酿造师保留了传统的酿造工艺,直到今天都使用一系列不同的酵母菌株制造啤酒。
在另一项研究中,美国威斯康星大学麦迪逊分校科学家克里斯·西金格及同事,分析了122种酵母杂交种的基因组。基因组信息揭示了一段涉及野生菌株和工业生产菌株的复杂杂交史。与酿酒酵母亲本杂交的杂交种可以分为3种驯化谱系,而另外3种亲本均为野生谱系。他们发现若干司陶特啤酒酵母和小麦啤酒酵母与拉格酵母谱系的相似性更大。西金格团队同时也鉴定出了耐冷性状的遗传路径。
综合而言,这两项研究展示了杂交如何促进酵母在酿造环境中的适应和多样化,为开发其他工业生产相关酵母杂交种提供了宝贵的信息。(记者张梦然)
研究揭示巨胞饮体成熟过程的分子机制4月4日,中国科学院生物物理研究所蔡华清课题组在《自然-通讯》(Nature Communications)上,发表了题为The PripA-TbcrA complex-centered Rab GAP cascade facilitates macropinosome maturation in Dictyostelium的研究论文。该研究揭示了巨胞饮体成熟过程中由Rab5、Rab7、PripA和TbcrA构成的Rab GAP信号级联通路调控巨胞饮体成熟和货物降解的分子机制。
巨胞饮(macropinocytosis)是细胞非选择性内吞胞外液体的过程。这一特殊的内吞行为在多种细胞类型中发生,例如阿米巴细胞利用其获取环境中的营养物质、免疫细胞利用其捕获抗原、神经细胞利用其内吞膜受体调节突触信号。巨胞饮也与许多疾病的发生相关,例如在神经退行性疾病中介导蛋白聚集体在细胞间的传递、被病原体利用入侵宿主细胞等。近年来,研究发现,某些肿瘤细胞可通过上调巨胞饮摄取蛋白质和脂肪酸等营养物质,从而在肿瘤微环境中维持生长优势。相比其他内吞过程,巨胞饮作用具有若干鲜明的特点。巨胞饮提供了一种内化大量溶质和膜的途径,巨胞饮体的直径一般在0.2~5微米,大于被广泛研究的网格蛋白形成的内吞泡的大小。巨胞饮不依赖包被蛋白或固体颗粒模板,而是由肌动蛋白驱动质膜发生形变,进一步形成内吞囊泡。这些巨胞饮过程特性的背后蕴藏复杂的调控机理,而目前对巨胞饮体形成和成熟的分子机制知之甚少。
为了解析巨胞饮体成熟过程的分子机制,蔡华清课题组利用模式生物Dictyostelium discoideum细胞开展研究。科研人员观察Rab小GTP酶的动态变化,发现巨胞饮体在从质膜上分离后会依次被Rab5和Rab7标记。在Rab5标记的早期巨胞饮体向Rab7标记的晚期巨胞饮体转变的过程中,Rab7并不像经典模型中描述的那样是从胞质中被招募到囊泡结构上。相反,当Rab5标记的早期巨胞饮体进入细胞中约20-30秒后,大量Rab7标记的晚期巨胞饮体定位在Rab5囊泡结构的周围并与之融合。这表明巨胞饮体成熟过程中Rab5向Rab7的转化依赖晚期巨胞饮与早期巨胞饮体的融合。
研究进一步通过对在Rab5向Rab7的转化阶段特异定位于巨胞饮体上的蛋白的筛选,发现了由包含PH结构域的一个蛋白和包含RabGAP结构域的一个蛋白组成的蛋白复合体,并将这两个蛋白分别命名为PripA和TbcrA。研究结合延时荧光成像、酵母双杂交和一系列生化实验证明,PripA分别与早期巨胞饮体上的PI(3,4)P2和晚期巨胞饮体上的Rab7结合,为两种巨胞饮体膜结构之间建立链接。同时,PripA招募TbcrA,而后者作为Rab5的GAP促进Rab5-GTP的水解,从而保证在晚期巨胞饮体与早期巨胞饮体融合的过程中Rab5被及时失活。pripA或tbcrA基因的缺失会抑制Rab5的失活,并阻碍巨胞饮体的成熟和内吞货物的降解。此外,研究发现PripA-TbcrA复合体在细胞吞噬细菌和酵母等微生物的过程中也发挥类似的功能,从而促进吞噬体的成熟。
该研究揭示了Rab5、Rab7和PripA-TbcrA复合物以Rab GAP级联(Rab GAP cascade)的形式,调控巨胞饮体成熟的分子机制。在该调控机制中,处于信号通路下游的Rab7通过膜融合的方式被富集到巨胞饮体上,Rab7再通过招募GAP蛋白抑制通路上游的Rab5的活性,从而确保巨胞饮体成熟过程中Rab小GTP酶转化的方向性,使细胞能够高效地处理巨胞饮内吞的货物,进而及时获取维持细胞生长和增殖的营养物质。该研究提出不同来源的内吞囊泡加工方式的多样性,这为探究细胞内吞过程的分子机制奠定了重要基础。
研究工作得到国家自然科学基金、科技部和中科院战略性先导科技专项等的支持。
Rab5、Rab7和PripA-TbcrA复合体构成的Rab GAP信号级联通路调控巨胞饮体成熟
来源:中国科学院生物物理研究所
在酵母杂交那些事儿(一)和(二)中,小远基本对各种类型的酵母杂交都做了介绍,当然也有没介绍到的,毕竟种类繁多,小远也就只能挑一挑为大家讲解,主要是想开拓大家对酵母杂交的了解,有些 *** 在植物领域的研究中可能比较少见,或者基本就没用过,但是也不妨碍大家对它进行了解,在介绍了这么多内容之后,今天小远终于可以实现诺言为大家讲一讲酵母杂交在文献中的应用实例啦!
01 酵母双杂实验结果解读
咳咳,在为大家列举文献案例之前,小远想以酵母双杂为例,为大家讲讲酵母双杂的实验结果到底应该怎么看!之所以把这个专门拿出来写是因为小远一开始接触的时候被它困扰过,为了大家不再被同样的内容困扰,小远决定将自己理解的知识写出来,帮助需要被帮助的同学,让大家少一点困扰!
图1 利用酵母双杂实验验证SPX6与PHR2相互作用(Zhong et al., 2018)。
对于这个酵母双杂的结果,很多人应该都能看懂,但也不排除看不懂的同学,为了让不懂的同学也能看懂这个结果,小远决定接下来仍要好好讲一讲!因为小远的目标是不放弃任何一个有疑问的同学哦!
在给大家讲如何去看这个结果之前,先给大家讲一些背景知识,这些背景知识对于大家理解实验结果是很有必要的!所以一起来听一听吧!与大肠杆菌采用抗生素筛选的策略不同,酵母系统常采用营养标记作为报告基因。常用的报告基因有 His3,Ura3,Leu2 和 Ade2 等(具体信息可参见表1),对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞,必须要在含有该营养标记的培养基中才能生长。Gal4系统中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生Gal4,又不能合成组氨酸(His)、尿嘧啶(Ura)、亮氨酸(Leu)、腺嘌呤(Ade)等,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。只有当转入对应的质粒且相互作用的蛋白存在时,才能激活报告基因的表达,从而通过功能互补,酵母才能够在不含营养标记的培养基中生长,据此来验证两个蛋白是否存在相互作用。同样,也可以通过显色反应进一步确认是否有相互作用。
表1 酵母双杂实验中使用的报告基因。
我们先看图片最上面的“+”和“-”,可以看到一共分三列,右边一列:SPX6-AD与PHR2-C-BD对应的位置都是“+”号,它代表的意思是将这两个质粒共转酵母菌株,作为该实验的实验组;中间一列:BD与SPX6-AD对应的位置是“+”号,表示将这两个质粒共转酵母菌株,作为该实验的对照组;左边一列:AD与PHR2-C-BD对应的位置是“+”号,它表示将这两个质粒共转酵母菌株,同样也是该实验的对照组。其中AD是质粒pGADT7的简称,携带Leu基因,BD是质粒pGBKT7的简称,携带Trp基因。
SD/-Leu-Trp表示缺亮氨酸和色氨酸的培养基,也就是二缺板,可以看出三组实验都长出了酵母菌落,也就是对应的质粒都转入了酵母菌株,具体来说就是AD载体携带Leu基因,转入酵母菌株后可以合成亮氨酸,BD载体携带Trp基因,转入酵母菌株后可以合成色氨酸,两个质粒都转入酵母菌株,酵母菌株就可以在对应的二缺板上生长。
二缺板证明了对应的质粒是否转入酵母菌株之后,接下来的四缺板就是为了证明两个蛋白之间是否存在互作。
SD/-Leu-Trp-His-Ade表示缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基,也就是四缺板,从图中可以看出在四缺板上只有实验组的酵母菌株能够生长,两个对照组的酵母菌株无法生长,这一结果就证明了SPX6与PHR2存在互作。其背后的原理是SPX6与PHR2存在互作就会使得AD与BD靠近重组成有功能的Gal4转录因子,Gal4激活下游的报告基因His和Ade的表达,酵母菌株就能合成组氨酸与腺嘌呤,加上AD和BD上携带的营养标记基因,其对应的酵母菌株就能在四缺板上生长,而对照组因为不存在互作,也就不能重组成有功能的Gal4转录因子,最终也就不能在四缺板上生长。
小远叨叨
1、在酵母双杂实验中,是需要检测BD载体上基因的自激活活性的,但是在发表的文章中一般会省略,放在补充材料中,这一点大家要清楚哦!具体的做法是将需要研究的基因A构建至BD载体上,即pGBKT7-A与AD空载体pGADT7共转酵母菌株,观察在三缺或四缺板上能否生长,若能生长,就证明基因A存在自激活活性,不能生长就说明基因A不存在自激活活性,只有在基因A不存在自激活活性的情况下才能进行后续的双杂实验。
2、注意区分蓝白班筛选中的X-Gal和X-α-Gal,它们并不是同一个东西哦!X-Gal是E.coliβ-半乳糖苷酶(LacZ)的反应底物,而X-α-Gal是酵母α-半乳糖甘酶(MEL1)的反应底物。
X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活。MEL1是Gal4酵母双杂交系统的一个报告基因,编码分泌α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色底物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色,即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用,利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays;
X-Gal用于检测LacZ基因合成的 β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌,需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能进行显色,因此操作流程相对繁琐。
携带MEL1基因的酵母菌株包括:Y2HGold、Y190、AH109、Y187、PG69-2A。
在明白了实验结果怎么看之后(这里只介绍了酵母双杂的结果,主要是因为酵母双杂很经典,其它的 *** 基本也都是在它的基础上发展而来的,对于酵母杂交很多东西也都是相通的,因此,小远相信介绍了这个,其它的大家应该也都会了。另外不同的文章以及不同的作者对结果的展现形式有所不同,但只要懂了其中的原理,不管形式怎么变你都不会被难倒哦!),下面就跟着小远一起去看看具体的文献实例吧!
02 文献应用举例
2.1酵母单杂交
在“Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metaboli *** by regulating carotenogenic genes”一文中作者为了解析CstMYB1和CstMYB1R2的作用机制,通过酵母单杂交(Y1H)的 *** 检测出了它们与类胡萝卜素途径基因PSY和CCD2启动子的相互作用。
首先,作者扩增并克隆了PSY和CCD2的启动子,并进一步扩增了100bp PSY和170bp CCD2启动子的天然片段。这些片段分别含有一个和两个MYB结合区域。另外,作者也相应地生成了它们的突变体结构(PSY一个,CCD2两个)。分别用天然和突变的启动子片段制备诱饵菌株,并通过检测每个诱饵菌株的最小aureobasidin A(AbA)浓度,推断它们与CstMYB1和Cst-MYB1R2的相互作用。对于PSY启动子,只有CstMYB1R2表现出相互作用,当突变型PSY诱饵株(pPSY-mut)的PSY启动子区段的MYB结合位点发生突变时,这种相互作用就会消失,这一结果表明了CstMYB1R2-PSY相互作用的特异性(图2a)。同时,作者还观察到CstMYB1、CstMYB1R2共转化 CCD2天然片段诱饵(pCCD2wt)的酵母细胞可以在添加了AbA的选择性培养基上生长,这证实了CstMYB1和CstMYB1R2与CCD2启动子的相互作用。然而,只有一个MYB结合位点发生突变的CCD2菌株(pCCD2mut1)可以在含有200 ng mL-1 AbA的选择培养基上生长,而两个MYB结合位点都发生突变的CCD2菌株(pCCD2mut2)无法在选择培养基上生长(图2b)。因此,CstMYB1仅与CCD2启动子直接结合,而CstMYB1R2同时与PSY和CCD2启动子结合。
图2 酵母单杂交实验显示CstMYB1和CstMYB1R2与启动子(a) PSY及其突变形式(b) CCD2及其突变形式的结合。转化子在SD-Ura-Leu上生长,并添加200 ng的AbA(Bhat et al., 2021)。
小远叨叨
这里的结果形式与上面的举例的结果形式有差别,但背后的原理基本都差不多,都是将对应的质粒共转化至酵母菌株中,能在对应的培养基上生长就能证明质粒转进去了以及存在相互作用。所以大家以后遇到不同的结果形式不要慌,把握住核心原理什么难题都能迎刃而解哦!
2.2核体系酵母双杂交
虽然上面解读结果的时候已经给大家讲过核体系酵母双杂交的案例,但是也不妨碍小远再给大家列举一个例子,这个例子中作者做了阳性对照(BD-p53,AD-T)与阴性对照(BD-Lam,AD-T),这两组对照实验可以认为是酵母双杂实验中公认的阳性对照与阴性对照,与研究动物还是植物的基因并没有太大关系哦!
图3 利用酵母双杂交分析EjAP2-1和EjMYB1/2的蛋白相互作用(Zeng et al., 2015)。将EjAP2-1融合到pGBKT7(BD)和EjMYB1/2融合到pGADT7 (AD)的组合共转化酵母菌株。以BD-p53、AD-T为阳性对照,以BD-Lam、AD-T为阴性对照。在不含Leu、Trp、His和Ade,有或没有AbA的SD培养基(SD/-Leu-Trp- His-Ade和SD/-Leu-Trp-His-Ade+AbA)上测定蛋白质的相互作用。
2.3膜体系酵母双杂交
在“Specificity of Plant Rhabdovirus Cell-to-Cell Movement”一文中,作者用到了分裂泛素膜酵母双杂交的实验 *** 验证了两个蛋白之间的互作,由于背景知识有点复杂(可能是接触的太少了),小远在这里就不给大家介绍那么多了,简单讲讲关于膜体系酵母双杂部分的实验结果,让大家清楚这类实验的思路应该是怎样的就好,至于根据结果得到了一个什么样的结论,大家有兴趣可以自己去看哦!
文中作者首先对SYNV和TYMaV的亚细胞定位做了一个分析,如下图所示:SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP主要定位在质膜中,另外,少部分的SYNV sc4-GFP也存在于细胞核中。
图4 SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP的亚细胞定位分析(Zhou et al., 2019)。
根据亚细胞定位的结果,作者选择以分裂泛素膜酵母双杂交的实验 *** 来验证SYNV和TYMaV两个蛋白分别与其它蛋白的N蛋白或P蛋白互作情况,具体结果如下:
将膜相关的SYNV sc4和TYMaV P3蛋白分别融合到泛素(Cub)和人工转录因子LexA-VP16的C端,而SYNV、TYMaV和R *** V的N蛋白分别以N端(X-NubG)或C端(NubG-X)融合到突变的泛素N端(NubG)。通过该实验,作者发现sc4特异地与SYNV的N蛋白相互作用,而与TYMaV和R *** V的N蛋白不存在相互作用(图5A)。同样,TYMaV P3只与同源的TYMaV 的N蛋白相互作用(图5B)。
与此同时,将SYNV、TYMaV和R *** V的P蛋白分别以N端(X-NubG)或C端(NubG-X)融合到NubG上。MYTH实验显示,SYNV sc4特异地与其同源P蛋白相互作用,而与非同源P蛋白不发生相互作用(图5C)。同样,也检测到同源的TYMaV P3-P互作,尽管TYMaV P3与R *** V P蛋白的互作比较弱(图5D)。
图5 用分裂泛素膜酵母双杂交(MYTH)分析杆状病毒MP-核衣壳核心蛋白相互作用(Zhou et al., 2019)。(A至D)诱饵包含与SYNV sc4 (A和C)或TYMaV P3 (B和D)融合的载体,猎物编码与NubG的N端(N-NubG)或C端(NubG-N)融合的SYNV、R *** V或TYMaV的N (A和B)和P (C和D)蛋白。酵母细胞与诱饵和猎物质粒共转化。转化子在缺亮氨酸和色氨酸的缺失培养基(SD-LW)上连续稀释10倍以确认两个质粒的存在。用缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤(SD-LWHA)培养基筛选阳性相互作用。
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通过这个例子我们可以发现,酵母双杂实验应该安排在亚细胞定位实验的后面,通过亚细胞定位的结果选择合适的酵母双杂 *** ,一般情况下,只要亚细胞定位不定位在细胞膜上,就可以选择核体系的酵母双杂进行后续实验,而定位在细胞膜上的蛋白就要选择膜酵母双杂交 *** !
2.4 酵母三杂交(3个蛋白互作)
在“A negative feedback loop of TOR signaling balances growth and stress-response trade-offs in plants”一文中,作者先利用酵母双杂以及荧光素酶互补实验分别验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B互作,然后又利用BiFC实验分别验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B在内质网中互作。根据这些已有的结果,作者进行了猜测并进行了酵母三杂交实验。
FLZ8与SnRK1α1和RAPTOR1B在相似的细胞质定位上相互作用表明:FLZ8可能作为一种支架蛋白,介导SnRK1α1与RAPTOR1B的相互作用。为了验证这一假设,作者采用酵母三杂交(Y3H)实验,其中FLZ8与SnRK1α1和RAPTOR1B一起,在葡萄糖抑制和半乳糖诱导启动子(GAL1)的控制下表达。在添加半乳糖的条件下,FLZ8的表达强烈增强了SnRK1α1与RAPTOR1B的相互作用(图6B),而在添加葡萄糖条件下生长的细胞中没有这种相互作用(图6A)。
图6 在添加葡萄糖和半乳糖的条件下,Y3H法分析FLZ8存在时SnRK1a1和RAPTOR1B的相互作用(Jindal et al., 2022)。
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这里的酵母三杂交需要知道谁是起桥梁作用的,如果不清楚,恐怕也很难用这个 *** 进行验证,就像本例中,如果选错了起桥梁作用的蛋白,例如选成了SnRK1a1,如果SnRK1a1与RAPTOR1B不互作,那么用这种组合方式进行的酵母三杂可能就得不到我们想要的结果了!当然在本例中我们也看到了起桥梁作用的蛋白也不是随意选的,都是在一定的实验基础上才进行了选择哦!所以我们要明白在平时的实验中很多实验都是环环相扣的哦!
小结
文章到这里就结束了,在本文中进行举例的 *** 是在植物科研领域的文献中经常出现的,但小远在酵母杂交那些事儿(一)和(二)讲的 *** 不止这些,剩下没讲的基本都是没找到相关文献的,可能那些 *** 在动物领域应用的比较多,但在植物领域应用的就比较少,如果大家有看到相关的文献可以与小远一起讨论哦!另外,在查找文献的过程中也有好多 *** 是小远没讲到的,大家有兴趣可以自己去查文献,“酵母杂交那些事儿”到这里就完结了,感谢大家的关注哦!
References:
Bhat Z Y, Mohiuddin T, Kumar A, et al. Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metaboli *** by regulating carotenogenic genes
Jindal S, Sharma M, Awasthi P, et al. A negative feedback loop of TOR signaling balances growth and stress-response trade-offs in plants
Zeng J, Li X, Xu Q, et al. EjAP2‐1, an AP2/ERF gene, is a novel regulator of fruit lignification induced by chilling injury, via interaction with EjMYB transcription factors
Zhong Y, Wang Y, Guo J, et al. Rice SPX6 negatively regulates the phosphate starvation response through suppression of the transcription factor PHR2
Zhou X, Lin W, Sun K, et al. Specificity of plant rhabdovirus cell-to-cell movement
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不同类型酵母杂交促进各类啤酒出现2019-10-22 08:11
科技日报北京10月21日电 (记者张梦然)根据英国《自然·生态与演化》杂志发表的两篇论文,不同类型酵母杂交可以促进杂交种适应酿造环境,促进不同类型啤酒出现。
几千年来,人类一直使用酵母制造不同的发酵产品,如啤酒和红酒。人类通过驯化方式创造出了许多可以适应不同工业环境的酵母品种,它们是综合了不同亲本种独特特征的杂交种。
比利时VIB-KU鲁汶微生物学中心科学家凯文·维斯特里芬及同事,此次测序了应用于工业生产活动(包括酿造)中的200种酵母的基因组,发现其中四分之一的酵母是4种亲本种的杂交种,并指出杂交帮助综合了可以改进酿造工艺的性状,比如耐冷和糖发酵。研究人员发现,如今的拉格酵母缺少遗传多样性,这可能是因为19世纪末培养、冷藏和供应的酵母菌株只有少数。但是,比利时的酿造师保留了传统的酿造工艺,直到今天都使用一系列不同的酵母菌株制造啤酒。
在另一项研究中,美国威斯康星大学麦迪逊分校科学家克里斯·西金格及同事,分析了122种酵母杂交种的基因组。基因组信息揭示了一段涉及野生菌株和工业生产菌株的复杂杂交史。与酿酒酵母亲本杂交的杂交种可以分为3种驯化谱系,而另外3种亲本均为野生谱系。他们发现若干司陶特啤酒酵母和小麦啤酒酵母与拉格酵母谱系的相似性更大。西金格团队同时也鉴定出了耐冷性状的遗传路径。
综合而言,这两项研究展示了杂交如何促进酵母在酿造环境中的适应和多样化,为开发其他工业生产相关酵母杂交种提供了宝贵的信息。
责编:李文瑶